全球疾病负担研究数据显示，我国人口寿命年减少的首要病因是脑卒中[1]。在我国，脑卒中的发病率与患病率整体呈上升趋势，其高致残率和高死亡率已成为成年人群死亡和伤残的首位病因[2]，而缺血性脑卒中约占脑卒中的70%[3]。脑卒中后患者通常会并发不同程度的功能障碍，在急性脑卒中患者中，约2/3的患者表现出不同程度的认知功能障碍。目前临床上认知功能障碍的诊断标准为患者既往无认知障碍但在脑卒中后6个月内，视空间、语言、执行功能/注意力、记忆等存在至少1个认知领域损害或下降[4]。在认知功能中，学习记忆是一项基本能力，为高等动物和人类具有特色的生理特性之一，学习、记忆功能障碍严重影响患者的日常生活能力，降低其生命质量和延缓神经功能康复。
本课题组前期基于电针穴位组（穴位选取神庭、百会）、电针非经非穴组、手针穴位组、手针非经非穴组的基础实验研究及初步临床实践观察均发现电针神庭、百会穴在改善脑卒中患者学习、记忆功能障碍时的治疗效果更佳[5，6，7，8，9]。但电针治疗作用的确切机制仍需要深入研究。基础医学研究理论表明，自由基代谢异常是脑卒中损伤形成的重要原因之一[10，11]。因此，本课题基于自由基代谢，探索电针神庭、百会穴治疗缺血性脑卒中患者学习记忆障碍的分子生物学机制，为脑卒中学习、记忆功能损伤的治疗提供新的靶点。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
购于济南朋悦实验动物繁育有限公司〔许可证号：SCXK（鲁）20190003〕体质量为190~210 g、健康成年雄性SPF级SD大鼠18只，按照规范化条件于中心实验室IVC屏障动物房适应性喂养至270~280 g（60~75日龄），自然照明，自由摄食、水。本研究通过河南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准（YFYDW2019001），整个过程严格遵照国际动物保护及使用指南的相关规定。
采用SPSS 22.0软件将SD大鼠进行完全随机化分组，分为假手术组（6只）、模型组（6只）和电针组（6只）。本研究时间为2019年8月至2020年8月。
1.2 主要实验仪器和试剂
仪器：Super Maze Morris水迷宫视频分析系统（XR-XM 101，上海欣软信息科技有限公司）；华佗电子针疗仪（SDZ-Ⅱ型，苏州医疗用品厂有限公司）；台式冷冻离心机（德国Biofuge stratos）；涡旋混匀仪（Vortex QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；酶标仪器（美国VersaMax）；大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型线栓（MSRC43B260PK50，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；无菌针灸针（环球牌，苏州针灸用品有限公司，规格：0.30 mm×25 mm）；非吸收性外科缝线（3-0）（扬州市华祥医疗器械厂）；LEICA 819一次性窄刀片（德国徕卡LEICA）。
试剂：酒精（卫辉市众诚消毒制剂有限公司）；碘伏（山东德新康医疗科技有限公司）；水合氯醛（上海麦克林生化科技有限公司，C804539-100 g）；硫酸庆大霉素注射液〔开封制药（集团）有限公司〕；呋塞米注射液（河南润弘制药股份有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）干粉（Solarbio：P1010）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio：PC0020）；总超氧化物歧化酶比色法测试盒（WST-1法）（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，E-BC-K020）；丙二醛比色法测试盒（TBA法）（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，E-BC-K025-M）。
1.3 动物模型制备
1.3.1 MCAO模型[12]
（1）术前准备：适应性饲养大鼠至目标体质量（270~280 g），术前将造模动物禁食12 h、自由饮水。准备好分离动脉所需的物品，造模由2名经培训的手法基本一致的实验人员同时进行，以避免因造模不同引起的误差。（2）麻醉：大鼠抓取尾部，将其放在电子秤上称量体质量，称重后按照3.5 ml/kg的剂量用10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉，检查大鼠角膜反射，消失为麻醉成功的标志。麻醉时注意进针的深度和角度，避免造成动物意外死亡。（3）分离动脉：麻醉成功后用剃毛器将SD大鼠颈前部的皮毛剃去，将其仰卧位固定在大鼠固定板上，用碘伏、医用乙醇消毒后备皮，在颈中线稍偏左侧做1个4 cm左右的切口，钝性逐层分离皮下组织，找到并将颈总动脉与迷走神经分离，并在颈总动脉近心端处预留结扎线。沿颈总动脉向远心端找到颈内动脉与颈外动脉的分叉并将两者分离。在颈外动脉远心端处预留结扎线，在颈外动脉近心端、颈总动脉近心端处结扎颈外动脉与颈总动脉。（4）插栓：用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，左手持弯镊将颈总动脉结扎处与分叉处撑起，右手用显微剪刀在距离颈内与颈外动脉分叉1 cm处剪V型切口，将线栓从颈总动脉切口处经分叉插入18~20 mm，稍感有阻力时即可停止插栓，用3-0的缝合线结扎V型切口处并记录下插栓时间，消毒后将皮肤切口缝合。切记留1 cm线栓在皮肤外。（5）再灌注：线栓插入2 h后，小心将线栓退至分叉处，以实现缺血再灌注。在手术期间及术后，室温保持在25 ℃左右，同时采用电热毯维持大鼠肛温在（37±1）℃，直至大鼠麻醉苏醒，恢复意识。
1.3.2 假手术组模型制备
大鼠仅做颈部皮肤切开，分离颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉，然后消毒切口、缝合皮肤。
1.3.3 造模后处理
术后麻醉恢复时要注意保暖，保持呼吸道通畅。术后3组大鼠均腹腔注射硫酸庆大霉素2 U/只，连续注射3 d，以预防感染。术后均腹腔注射呋塞米注射液，剂量为0.1 mg/kg，防止脑水肿。
1.4 模型制备成功的标准
动物麻醉完全清醒后，按照Zea-Longa法[13]（0分：无神经缺损症状，1分：无法完全伸展对侧前爪，2分：向右侧转圈，3分：向对侧倾倒，4分：意识丧失，无法自发行走）对MCAO模型大鼠进行评分，筛选分值为1~3分的大鼠为成功的动物模型，纳入模型组、电针组。0分和4分失败的动物模型不纳入本次实验研究。
1.5 干预方法
1.5.1 电针组
腧穴定位：参考《实验针灸学》[14]和《实验动物常用穴位名称与定位第２部分：大鼠》[15]并模拟人体腧穴骨度分寸法定位取穴：神庭穴位于大鼠头前正中线，额顶骨缝交界线前方；百会穴位于大鼠头部前正中线，双耳尖连线中点。
电针方法：术后第1天开始电针治疗，选用直径0.3 mm的环球无菌针灸针分别刺入神庭穴（向上斜刺，深度约2 mm）、百会穴（向前斜刺，深度约2 mm），进针后连接SDZ-Ⅱ型华佗电子针疗仪，疏密波频率为1 Hz/20 Hz，强度以针体轻轻抖动、动物耐受为度，1次/d，30 min/次，连续治疗2周，直至动物被处死。针刺干预由同一人员进行操作。
1.5.2 模型组和假手术组
术后于笼中饲养，除同等条件抓取固定30 min外，不给予任何干预措施。
1.6 检测指标与方法
1.6.1 Morris水迷宫实验
Morris水迷宫实验设置参照设备说明书和参考文献[16]设置，主要包括定位航行和空间探索两部分实验。
定位航行实验：在动物每天电针治疗结束后，分上、下午2个时段训练，每次训练将动物面朝池壁从4个不同的象限依次放入水迷宫中，记录从不同象限将动物放入后，动物找到逃生平台的时间（即逃避潜伏期）；动物如果在90 s内找到逃生平台，并在其上停留3 s以上，则认为动物找到逃生平台；如果动物在90 s内未找到逃生平台，则由实验者借助外物对动物进行引导，找到逃生平台并熟悉10 s，此时动物的逃避潜伏期界定为90 s。此部分实验时间从电针治疗第9天开始，第13天结束，持续5 d。
空间探索实验：本实验于第14天电针治疗结束后进行。撤掉池壁内的逃生平台，将大鼠按照相同的操作从离原平台位置最远象限投入池内，并记录动物在90 s内穿越逃生平台的次数。
1.6.2 脑组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测
组织样本采集：Morris水迷宫行为学测试结束后，抓取各组大鼠称重后采用10%的水合氯醛以4 ml/kg的剂量进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后迅速断头取脑，用LEICA手术刀片于冰上准确分离出梗死侧脑皮质，将其放入预先配置的4 ℃ PBS溶液中漂洗血液，漂洗结束用滤纸吸干并适量等分称重，以重量与体积为1∶9的比例加入4 ℃的PBS进行研磨。
WST-1法检测：研磨结束后，将各组样本置于冷冻离心机中以4 ℃、1 500×g的速度离心10 min，使用移液器吸取上清液置于2 ml EP管中。取适量上清液100倍稀释后，用BCA法测各组样本的蛋白浓度。筛选条件满足SOD抑制率在40%~60%的样本，根据测得的蛋白浓度计算各样本适合的稀释倍数，并配置稀释液分装（于-80 ℃保存备用）。按照总超氧化物歧化酶比色法测试盒（WST-1法）说明书配制试剂并进行实验操作，测量样品在450 nm处光密度值（OD值），运用公式计算大鼠脑组织SOD活性。
TBA法检测：组织样本研磨结束后，将其置于冷冻离心机中以4 ℃、10 000×g的速度离心10 min后，使用移液器吸取上清液分装（于-80 ℃保存备用）。按照丙二醛比色法测试盒（TBA法）说明书配制试剂并进行实验操作。测量样品在532 nm处OD值，根据公式计算大鼠脑组织中MDA含量。
1.7 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较釆用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
模型组和电针组大鼠均造模成功。
2.1 电针神庭、百会穴对大鼠Morris水迷宫实验行为学的影响
三组大鼠第13天逃避潜伏期、穿越平台次数比较，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组大鼠第13天逃避潜伏期长于假手术组，穿越平台次数少于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）；电针组大鼠第13天逃避潜伏期短于模型组，穿越平台次数多于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；电针组与假手术组大鼠第13天逃避潜伏期、穿越平台次数比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 电针神庭、百会穴对大鼠脑组织SOD、MDA表达的影响
三组大鼠SOD活性、MDA含量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组大鼠SOD活性低于假手术组，MDA含量高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）；电针组大鼠SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；电针组与假手术组大鼠SOD活性、MDA含量比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
3 讨论
缺血性卒中又被称作脑梗死，是指在内外因作用下，中枢神经系统的血液供应障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化，进而造成相应的神经系统功能损伤，当脑组织血液供应受阻以后，缺血中心的坏死区及其周围的缺血半暗带会迅速出现在相应缺血区域，此为脑卒中的超早期。在脑卒中超早期以恢复血流灌注、挽救缺血半暗带为目的的治疗方法，可以减小脑梗死的面积。所以，超早期的溶栓治疗、机械取栓是最先进的药物、介入治疗方法[17]。尽管恢复血流再灌注是治疗的关键，但在临床实践中发现，在缺血基础上恢复血流后脑组织结构功能损害不但没有减轻，反而加重甚至出现不可逆性改变的现象，即脑缺血/再灌注损伤。
脑缺血/再灌注损伤的临床表现为脑损伤和神经功能障碍加重，其中约2/3的患者表现出不同程度的认知功能障碍。现代医学研究认为，认知功能是大脑的高级神经活动，主要包括注意力、定向力、语言、视空间及执行、学习与记忆等方面，其中特别是注意力、记忆力和执行功能（即集成多个复杂过程）的损害可能会致残[18]。《卒中后认知障碍管理专家共识2021》[19]将胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐等药物作为Ⅰ级推荐、A级证据用于卒中后认知障碍的治疗，可改善患者的认知功能和日常生活能力。临床实践中认知障碍的康复方法包括认知干预、神经调控技术、音乐治疗、传统康复方法等，涵盖多认知领域[20]，但因经济发展水平和医疗资源的限制，目前药物及认知康复疗法存在治疗价格高、周期长等弊端。针刺对脑卒中后认知障碍的治疗有比较深刻的认识和丰富的临床经验。《中医康复临床实践指南·脑卒中》[21]中将电针或头针联合认知训练作为B级证据推荐给脑卒中后认知障碍患者的临床治疗。
针灸是中医学的重要治疗方法，不良反应少，疗效独特，并且与常规针刺相比，电针可以将毫针刺激与电生理效应结合，具有施针时程长、刺激量强、针感持久、方便灵活调整刺激量等优点。詹杰等[22]关于电针治疗脑卒中后认知障碍的Meta分析指出，脑卒中后认知功能障碍患者简易智力状态检查量表评分、蒙特利尔认知评估量表评分、P300波幅和潜伏期及临床表现在电针治疗后有明显的改善。陈潞婷等[23]指出电针百会、大椎穴可激活神经生长因子（NGF）-酪氨酸激酶受体A（TrkA） 信号通路，进而可以改善脑缺血大鼠的学习、记忆障碍。HE等[24]研究发现电针可通过调控Wnt/β-catenint通路对MCAO动物模型发挥神经保护作用，进而改善其学习、记忆障碍。
督脉起于胞中，入脑、络心肾，为肾精转输入脑的通路，为人体诸阳之总汇，有"总督诸阳"和"阳脉之海"之称。"病变在脑，首取督脉"为治疗脑部疾病的首选。神庭穴属督脉，位置在头前部入发际五分处，为督脉、足太阳、阳明之会，能宁神醒脑、降逆平喘，对神经系统有治疗作用。百会穴是督脉、足太阳之会，其定位在头顶正中线与双耳尖连线的交叉处，位居颠顶部，深处为脑之所在，是调节大脑功能的要穴。刘芳等[5]关于一项针刺百会、神庭穴治疗脑卒中后认知功能障碍临床疗效的系统评价指出，与单纯认知康复训练或药物治疗相比，针刺治疗时取穴包含神庭、百会穴治疗认知功能障碍的疗效更佳。冯晓东[6]研究发现，脑卒中患者的简易智力状态检查量表、日常生活活动评分在电针神庭、百会穴配合康复训练治疗后较单纯康复训练有显著改善。黄佳等[7]进行的基础研究表明，电针神庭、百会穴可调节缺血/再灌注损伤后的神经炎性反应，改善大鼠的学习、记忆能力。冯晓东等[8]、黄金等[9]认为电针神庭、百会穴可通过调控自噬相关蛋白的表达，改善脑缺血/再灌注损伤所引起的学习、记忆障碍。临床及基础研究均表明电针神庭、百会穴可作为脑缺血/再灌注损伤学习、记忆障碍的一种治疗方法。
生理状态下，生物组织内不仅可产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等自由基，同时也存在酶抗氧化和非酶抗氧化系统，上述两者共同维持机体组织的平衡状态；但在病理因素的影响下，机体的平衡状态被破坏，导致自由基在体内异常聚集并产生副作用[25]。脑组织对缺血、缺氧敏感且抗氧化能力弱，自由基对脑组织的攻击不仅消耗大量抗氧化物质，而且会造成蛋白质变性、脂质过氧化、多核苷酸链断裂，导致细胞结构完整性被破坏，进而影响其正常生理功能[26]。而ROS已被证明是包括学习和记忆在内的基本认知功能的关键信号分子，可调节如N-甲基-D-天冬氨酸受体依赖性信号传导、细胞内Ca2+的调节等涉及长时程增强作用和记忆的信号通路，是信号转导级联的重要调节剂，其在突触可塑性和记忆形成中起着重要和必要的作用[27]。SHI等[28]研究发现针灸可通过抑制脑缺血中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导的ROS的产生而发挥神经保护作用，改善学习、记忆等认知功能障碍。故从自由基代谢异常的角度出发，寻找治疗脑缺血/再灌注损伤学习、记忆障碍的治疗方法具有重要的意义。
MDA是自由基与脂质发生过氧化反应的终产物[29]，因有细胞毒性，所以当其大量蓄积时可导致蛋白质、核酸等大分子物质交联聚合，进而破坏细胞膜的结构和功能。因MDA与氧化应激和脂质过氧化程度呈正相关[30]，MDA含量可直接反映机体细胞脂质过氧化程度，间接反映细胞受自由基攻击的严重程度[31]。细胞抗氧化酶活性水平可间接反映机体清除氧自由基的能力[32，33，34]。故采用检测酶活性的变化间接反映机体内自由基水平及其抗氧化能力的方法可以避免由自由基性质活跃、寿命短、检测技术复杂且费时等不利因素导致检测结果误差较大的缺陷。SOD是机体重要的抗氧化酶，在维持机体的氧化平衡状态中发挥至关重要的作用。SOD能催化自由基超氧阴离子（O2-）发生歧化反应生成氧和过氧化氢，抑制了黄嘌呤氧化酶催化的WST-1与O2-的反应，使水溶性的甲臜染料生成减少，故可利用此原理通过对产物甲臜染料的分析计算SOD的活性。本实验结果显示，电针神庭、百会穴可提高抗氧化酶SOD活性，减轻大鼠脑组织脂质过氧化产物MDA的蓄积，降低了ROS对细胞结构的破坏，改善脑缺血/再灌注损伤大鼠的学习、记忆功能障碍，发挥其认知保护作用。侯志涛等[35]在研究电针对脑缺血大鼠学习、记忆障碍的影响时发现，"智三针"干预可使动物组织内SOD活性提高、MDA含量降低，该研究认为电针是通过改善组织内氧自由基含量、抑制细胞凋亡而发挥认知保护作用，改善学习、记忆能力。黎娜等[36]研究发现，术后认知功能障碍老龄小鼠在接受电针大椎、百会穴预处理后，脑组织内ROS、MDA含量降低，SOD1、SOD2蛋白表达显著增加，认为电针预处理可通过降低组织内氧化应激水平而有效改善术后认知功能障碍老龄小鼠学习、记忆能力。本实验研究结果与上述研究结果一致，提示电针神庭、百会穴改善脑缺血/再灌注损伤大鼠的学习、记忆功能障碍的机制可能与减轻大鼠脑组织脂质过氧化产物MDA的蓄积，提高抗氧化酶SOD活性，减轻自由基对机体的造成的损伤有关。
本研究也存在一定的不足之处：由于实验条件的限制，在MCAO动物模型制备过程中未能采用激光多普勒血流测量仪对动物脑部血流进行实时监测，以反映脑组织再灌注血流变化，观察再灌注后的具体情况。
综上，电针神庭、百会穴可作为临床脑卒中认知功能障碍患者治疗的借鉴，其理论探讨可作为相关研究的参照。今后可从自由基代谢的角度出发，从电针神庭、百会穴调节氧化应激的通路进一步深入研究，以期为脑卒中认知障碍患者提供更多的治疗靶点。
本文无利益冲突。
参考文献 略
本文来源：闫晓, LEE JAEMYUNG, 张铭, 等. 电针神庭穴和百会穴对脑缺血/再灌注损伤后学习记忆障碍大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响研究[J]. 中国全科医学, 2022, 25(23): 2892-2898.（点击文题查看原文）
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发表于 2022-8-6 07:42:20
